近年来辅助生殖技术(ART)一直在迅速发展,玻璃化冷冻技术已经广泛用于人类和其他哺乳动物的胚胎和卵子的保存[1], 与传统的程序性慢速冷冻相比, 该方法大大缩短了操作时间并且减少了胞内冰晶对细胞的物理损伤, 从而提高了胚胎冷冻的效率和复苏存活率[2]。但是近年来冻融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer, FET)的种植率仍停留在一个较低的水平, 有研究者认为胚胎在体外培养、储存于极低的温度以及患者高龄等因素可能会使胚胎透明带变硬, 从而导致透明带孵化失败[3], 影响移植胚胎的着床率。为了提高胚胎种植率和临床妊娠率, 在胚胎移植前通过人为手段在透明带上形成一个开口或削减透明带厚度, 促使透明带破裂以帮助胚胎孵出的技术就是辅助孵化技术(assisted hatching, AH)。该技术最早应用于1990年,多数学者认为[4-6], AH技术可提高反复胚胎移植失败者和高龄患者的临床结局, 但是, 也有许多研究者对此持反对意见[7]。AH为胚胎侵入性操作技术, 是否可被作为辅助生殖实验室的一项常规操作至今存在争议, 在各个生殖中心的应用指征仍未形成统一的共识, 同时AH操作对妊娠后母儿的安全性也成为大家关注的焦点。本文对在本院生殖中心行 FET 周期的患者资料进行回顾性分析, 比较 AH 操作后移植与未行AH 操作患者的临床妊娠率、胚胎种植率、流产率、活产率以及母体并发症的发生情况, 探讨AH侵入性操作对不同年龄段妇女 FET后临床结局的影响, 为ART中AH操作的应用指征及母儿安全性研究提供理论依据。
1.1 研究对象 回顾性分析本院生殖医学中心2014年1月—2015年10月期间接受常规体外受精/卵胞质内单精子显微注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)治疗的患者, 在进行新鲜胚胎移植后未成功妊娠或全部胚胎冷冻的患者中, 将可利用胚胎(IV 级以上)进行玻璃化冷冻后行FET, 其中FET 2枚第3日(D3)胚胎的患者纳入本次研究。FET 时行 AH 操作的患者纳入 AH 组, 未行 AH 操作的患者为对照组。AH的应用指征: ①高龄患者(女方年龄≥38岁); ②移植后胚胎种植失败者; ③透明带厚度超过15 μm者;④冷冻胚胎。患者术前均进行血压、血常规、肝肾功能、凝血功能等常规检查, 均无异常。
1.2.1 促排卵及取卵 完善术前相关检查, 开始促排卵前于患者月经第 2~3 日检测基础 FSH 水平, 按照本中心标准长方案、短方案、拮抗剂方案或者微刺激方案进行, 当最大卵泡直径达到18 mm, 同时有3个卵泡直径>16 mm时, 注射人绒毛膜促性腺激素(h CG)艾泽(雪兰诺制药公司)250 μg, 34~36 h后超声引导下取卵。根据男方精子质量采取自然受精或ICSI受精。在胚胎移植日(取卵后第3日)对胚胎生长速度、形态学等指标进行胚胎评分, 选择可利用胚胎(I~III级)进行移植或冷冻保存。胚胎分级根据以下标准, ①I 级: 胚胎卵裂球等大, 无胞质内碎片或极少量(<5%)胞质内碎片; ②II级: 胚胎卵裂球等大, 有少量(5%~25%)胞质内碎片; ③III 级: 胚胎卵裂球明显不等大, 无胞质内碎片或极少量(<5%)胞质内碎片; ④ IV级: 胚胎卵裂球明显不等大, 有少量(5%~25%)胞质内碎片; ⑤V级: 胚胎卵裂球等大或不等大, 胞质内有大量(>25%)碎片; ⑥VI 级: 卵裂球数及碎片均看不清。
1.2.2 胚胎玻璃化冷冻和复苏 胚胎的玻璃化冷冻操作均在室温下进行, 将移植后剩余的可利用胚胎(I~III级)行玻璃化冷冻, 冷冻方法按丹麦Origio公司的Embro Vitri System-Cooling 试剂盒说明书所述方法进行, 冻融胚胎复苏按丹麦Origio公司的Embro VitriSystem-Warming 试剂盒所述方法进行。解冻后卵裂球复苏> 50% 即为解冻成功。移植 2 枚卵裂球完整存活的胚胎。
1.2.3 子宫内膜的准备 子宫内膜的准备主要采用自然周期方案、促排卵周期方案和激素替代周期方案。自然周期方案: 月经第 10 日 B 超检测卵泡发育和子宫内膜情况, 子宫内膜厚度≥7 mm 时, 在排卵日加用黄体酮(40 mg/d, 浙江仙琚制药), 因为是第3 日胚胎，故选择排卵后的第 3 日为移植日。促排卵周期方案: 月经第3~5日起, 根据患者既往卵巢功能和对促性腺激素(Gn)的反应情况, 给予人绝经期促性腺激素(h MG, 珠海丽珠制药)75~150 U, qd。当主卵泡生长至直径≥18 mm时, 给予h CG 10 000 U,48 h后如超声观察已排卵, 予以黄体酮40 mg, qd。如未排卵则测定血孕酮(P)水平, 达到黄体期水平者(P>3.34 ng/m L)也同样给予黄体酮 40 mg/d。选择排卵后的第3日为移植日; 激素替代周期准备内膜:口服戊酸雌二醇(6 mg/d, 拜耳制药), 当内膜厚度≥7 mm时用黄体酮40 mg/d内膜, 内膜的第 4 日为移植日。
1.2.4 AH和胚胎移植 纳入本研究的患者, AH均使用透明带激光削薄法辅助孵化, 将解冻胚胎置于倒置显微镜下, 选择合适的激光强度依次发射激光进行削薄, 孵化区域约为1/4 透明带周长、深度约为透明带厚度的70%~80%, 可适当增加能量, 原则是不能伤及胚胎细胞, 不能穿透内侧透明带, 孵化操作结束后将胚胎转移至移植液内, 培养2 h 后等待移植。移植后给予黄体酮进行黄体支持, 2 周后验血h CG, h CG 阳性者(>10 IU/L)为生化妊娠, 移植后4~5周行超声检查, 见孕囊及原始心管搏动则诊断为临床妊娠。
1.2.5 随访 分别于患者孕24周及预产期后1~2个月间进行电话随访, 内容包括分娩日期、分娩方式、产科并发症、新生儿的性别、胎龄、出生体质量、出生缺陷等。1.3 统计学方法 统计资料采用SPSS20.0软件处理, 结果以均数±标准差(x- ±s)或百分率(%)表示。计量资料采用t检验, 计数资料采用χ2检验; P<0.05认为差异有统计学意义。
2.1 正常年龄组(<38岁)AH组与对照组的比较 在正常年龄组患者中, AH组与对照组母亲年龄、父亲年龄、不孕年限方面组间比较无统计学差异(P>0.05)。在对照组中, 胚胎种植率、临床妊娠率、活产率、多胎率均高于 AH 组, 流产率低于 AH 组,并且差异有统计学意义(P<0.05), 详见表1。
2.2 高龄患者AH组与对照组的比较 在高龄(≥38 岁)患者中, 与对照组相比, AH组与对照组母亲年龄、父亲年龄、不孕年限方面组间比较无统计学差异(P>0.05)。而 AH 组胚胎种植率、临床妊娠率均高于对照组, 但差异无统计学意义(P>0.05)。AH组的流产率略高于对照组, 活产率略低于对照组, 此差异也无统计学意义(P>0.05), 详见表2。
2.3 AH与对照组围产期情况比较 AH组与对照组比较, 早产率、死胎率、母体并发症、男女比例、胎龄、出生体质量、新生儿缺陷率等组间均无统计学差异(P>0.05)。但对照组活产率、多胎率均高于AH组, 并且差异有统计学意义(P<0.05), 详见表 3 。
目前在大多数IVF取卵周期中会存在新鲜胚胎移植后胚胎剩余的情况, 胚胎冷冻技术的应用可明显提高患者单次取卵的累计妊娠率, FET是人类ART的重要组成部分, 能最大限度地增加妊娠机会, 减少胚胎的浪费, 其中玻璃化冷冻保存技术以其快速、简便、复苏存活率高等优点, 已经被广泛应用于各个辅助生殖中心。但由于冻融过程中, 细胞内冰晶形成和渗透压效应导致卵裂球受损, 透明带变硬, 非理想的体外培养条件, 女方年龄等因素均可导致透明带硬化、弹性下降, 致使体外发育的胚胎在移植后不能正常从透明带孵出, 增加了囊胚期胚胎孵出的难度, 从而影响移植胚胎的着床率[8]。因此有学者提出[9], 需要在FET 前对其进行AH 操作, 以利于胚胎的顺利孵出和着床。随着科学技术的发展, AH有多种方法, 包括机械法、激光法和酸化法等[10], 其中激光AH是目前最常用的方法, 激光通过显微镜经液体传导至透明带, 利用热效应使透明带发热融解, 达到融解透明带的目的, 多用于反复着床失败、高龄、胚胎质量较差或 FET 的患者[9]。
AH 是否能够增加胚胎着床的效率迄今仍然存在争议, 多项研究结果表明[11-15], AH 可促进孵化过程及允许胚胎与子宫内膜早期接触, 从而增加胚胎的着床能力, 提高患者的种植率及临床妊娠率。AH技术能够明显改善FET患者的妊娠结局[13], 然而, 有研究者认为 AH 技术并不能明显改善 FET 患者的妊娠结局, 甚至可能会降低FET 患者的胚胎种植率[16-17], 杜生荣等[18]的研究结果表明, AH 并不能明显改善胚胎的着床能力, 对第3日胚胎的结局没有明显的改善。目前临床操作中该技术的应用并无统一指征。
在本研究中, 我们以移植玻璃化冻融期胚胎的患者为对象, 进行AH 效果研究, 将患者以年龄<38岁和≥38岁分组后进行分析, 结果表明<38岁患者期胚胎 AH 后胚胎种植率、临床妊娠率、活产率均低于对照组, AH 并不能改善其临床结局, 这与Valojerdi等[11]、Hageman等[17]报道的AH并不能改善年龄<38 岁患者的临床结局的结论一致。在高龄妇女(≥38岁)FET周期中, AH组胚胎种植率、临床妊娠率高于对照组, 可能由于样本量偏少, 使该结果无统计学差异, 但是仍提示我们, AH 可以改善高龄妇女 FET 周期的种植率、临床妊娠率。我们的研究结果还表明, 在 2个年龄分组中AH患者移植后的流产率较对照组均增高, 其原因可能是激光的热效应对移植前胚胎造成了一些不良影响, 降低了胚胎后期的发育潜能, 但这仅限于一种推测, 需要我们在今后的研究中扩大样本, 进一步加以验证。高龄患者虽然临床妊娠率有改善, 但是由于流产率较高(32.14%),活产率与对照组相似, 妊娠结局无明显改善。因此,我们不提倡对冷冻胚胎进行常规化的 AH 操作。
近年来, 随着AH技术的广泛应用, AH 子代的健康问题开始备受关注。AH 对活产率和畸形率的影响并没有一致的结论。2004年Primi等[19]对62个AH 后出生的婴儿进行追踪, 结果AH对胎儿畸形率并无影响。Kanyó 等[20]分析了 134 例婴儿, 结果 AH并没有增加胎儿的畸形和染色体异常的比例。另外, 目前缺乏关于 AH 后的胎儿畸形、妇女围产期、分娩期及新生儿染色体异常等风险评估的研究[21]。
在我们的研究中, 本研究中母体妊娠相关并发症AH组与对照组比较没有差异, AH 组出生的婴儿早产率、胎龄、胎儿体质量、出生男女比例、新生儿缺陷率及新生儿死亡率与对照组相比无统计学差异,其中AH组有3例畸形, 对照组2例畸形, 表明AH对胚胎的正常发育无不良影响。但是, 本项研究为样本量较小的回顾性研究, 其结论的可靠性还有待进一步研究, 今后将长期对这些患儿进行持续追踪随访。
综上所述, 对于正常年龄患者, AH 并不能提高卵裂期FET的临床妊娠率和胚胎种植率, 不必对所有玻璃化冻融的卵裂期胚胎常规行AH; 但对于高龄患者, AH操作可能改善胚胎种植率及临床妊娠率, 今后需要更多大样本量进行深入研究, 以评估AH对高龄患者 FET 的作用。此外, AH 操作的远期安全性尚需继续追踪研究, 临床工作中对于FET 前进行激光 AH 应持谨慎态度。
来源：赵美、吴海霞、陈智勤、潘家坪等，冻融胚胎移植中辅助孵化对妊娠结局及安全性的影响[J].中华生殖与避孕，2017，37（9）：693-697.
