作者：武龙梅、邹薇薇、纪冬梅、陈福才，安徽医科大学第一附属医院妇产科生殖医学中心, 安徽医科大学生殖与遗传安徽省重点实验室, 安徽省生命资源保存与人工器官工程技术研究中心
随着辅助生殖技术(ART)的不断发展, 尤其是玻璃化冷冻技术在生殖医学领域中的广泛应用, 囊胚冻融后移植在临床上受到了广泛认可。冻融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer, FET)具备以下优点: ①囊胚越过了胚胎基因组激活阶段, 有利于剔除发育差及染色体异常的胚胎, 自然选择具备发育潜能的胚胎, 移植后的种植率更高、活产率增加; ② 近年来大量研究[1-4], 冻融囊胚移植妊娠结局显著优于新鲜囊胚移植, 能够提高累积妊娠率, 降低流产率, 并能预防卵巢过度刺激综合征(OHSS)的发生。影响FET妊娠结局的因素很多, 一般认为胚胎质量最重要。但目前关于移植不同发育冻融囊胚的临床结局仍存在争议。Kovalevsky 等[5]认为第 5日囊胚冻融移植后临床妊娠率、种植率和出生率显著高于第6日囊胚; 但Hiraoka等[6]研究表明第5日和第 6 日囊胚冻融移植的临床结局并无明显差异。近几年有大量研究[7-8], 单胚胎移植有助于减少多胎妊娠、胎膜早破、早产儿、低出生体质量儿的发生, 降低围产儿的死亡率, 单胚胎移植的预后优于双胚胎移植。因此, 本研究首先对 1 041 个冻融囊胚移植的妊娠结局进行回顾性分析, 比较第5日与第6日的单囊胚移植(single embryo transfer, SET)、双囊胚移植(double embryo transfer, DET)后的妊娠结局, 进一步对1 041个周期中移植囊胚均是优质囊胚的各组以及相同囊胚级别的第5日和第6日SET进行比较, 并对135例植入前遗传学诊断(preimplantationgenetic diagnosis, P)周期第5日、第6日SET妊娠结局进行回顾性分析, 旨在为临床上移植时冻融囊胚的选择提供依据, 并进一步探讨 SET 的可行性。
1.1 研究对象 以2014年8月—2016年8月期间在安徽医科大学第一附属医院生殖医学中心进行首次解冻囊胚移植助孕治疗的不孕症患者为研究对象,并分为 2个部分。第一部分纳入标准: ①年龄<35岁;②首次进行解冻移植的第 5 日、第 6 日单、双囊胚; ③不孕原因为盆腔输卵管因素或男方因素; ④无遗传性及家族性病史。排除标准: ①有习惯性流产史、不良妊娠史; ②子宫生殖道畸形; ③疤痕子宫(剖宫产、子宫肌瘤挖除史); ④合并子宫肌瘤、子宫内膜息肉; ⑤卵巢功能减退、子宫内膜异位症、多囊卵巢综合征等。第二部分 P 周期纳入标准:①年龄<35 岁; ②患有单基因病、反复移植失败、反复流产以及严重男性因素不育等; ②首次进行解冻移植的第 5 日、第 6 日正常单囊胚。排除标准:①子宫生殖道畸形; ②疤痕子宫(剖宫产、子宫肌瘤挖除史); ③合并子宫肌瘤、子宫内膜息肉; ④卵巢功能减退、子宫内膜异位症、多囊卵巢综合征等。
1.2 囊胚培养 根据患者基本情况采用本中心常规促排卵方案。女方取卵当日, 男方法或手术穿刺法取精, 采取上游法或者梯度离心法处理。获取的卵母细胞置于受精培养液中(fertilization液, 美国 Cook 公司)。h CG 注射后 39 h 行体外受精 / 卵胞质内单精子显微注射(IVF/ICSI)受精。授精后4~6 h观察受精情况, 并将受精卵转移至卵裂期培养液(cleavage液, 美国Cook公司)中。观察第3日胚胎卵裂数、细胞形态和碎片情况, 评估卵裂期胚胎质量, 然后将胚胎移入囊胚培养液中(blastocyst, 美国Cook公司), 继续培养到第5日或第6日, 观察囊胚形成情况, 采用Gardner囊胚评分法进行评分[9], 优质囊胚定义: 囊胚评分≥3BB, 并将囊胚进行玻璃化冷冻。全部胚胎冷冻的指征包括①取卵多, 卵巢体积增大, 有发生OHSS的可能; ②患者子宫内膜偏薄或者过厚; ③h CG注射日孕酮过高; ④胚胎需进行P 检测; ⑤生殖系统疾病如炎症、输卵管积水等; ⑥性疾病如发热、腹泻、高血压、糖尿 病 等 。
1.3 囊胚的玻璃化冷冻-解冻 囊胚冷冻前采用Hamilton激光软件进行激光皱缩, 在透明带和外胚层交界处打孔, 避开囊胚内细胞团(inner cell mass,ICM), 囊液流出囊胚体积稍变小, 约5 min后皱缩。室温下, 将囊胚移入平衡液(ES), 5 min后转移至玻璃化冷冻液(VS)中, 60 s内将囊胚放至标记的冷冻载体Cryotop上(日本Kitazato公司)并迅速浸入液氮中保存。解冻时将 Cryotop 浸入 37 ℃解冻液(TS)中1 min, 然后将胚胎移至稀释液(DS)和洗涤液1、2(WS1、WS2)中各 3 min。最后将胚胎转移至囊胚培养液中并置于培养箱内(平板培养箱, 美国Cook公司)培养。复苏 2 h 后观察囊胚的存活情况。囊腔存活标准判断: 复苏后囊胚的层细胞和内细胞团细胞存活> 5 0 % 。
1.4 囊胚移植及妊娠结局判断 本中心冻融周期囊胚移植的原则: ①首次解冻移植优先选择优质囊胚; ② P周期中经遗传学诊断为正常囊胚进行冻存待移植。囊胚移植的内膜准备分为自然周期(natural cycle, NC)和人工周期(hormonal replacementcycle, HRT)。NC 适用于月经周期规律的患者, 通过经超声监测, 优势卵泡直径≥14 mm,内膜厚度≥8 mm, 排卵后第5日为解冻囊胚日, 排卵日开始口服地屈孕酮10 mg, bid。HRT 适用于经欠规律、排卵障碍以及 NC 内膜或卵泡发育欠佳的患者, 自月经第3日口服戊酸雌二醇(补佳乐, 拜尔制药厂)4 mg/d×5 d, 根据内膜情况调整剂量及。10~14 d 后超声(TVS)监测子宫内膜厚度≥8 mm时, 肌肉注射黄体酮60 mg/d (20 mg/支,浙江仙琚制药股份有限公司), 排卵后第5日解冻囊胚(包括第5日及第6日所冻囊胚)并于B超引导下移植。生化妊娠: 移植后14 d测血h CG阳性; 临床妊娠: 移植后30 d行B超检查宫腔内孕囊数目及心管搏动。优质囊胚率 = 首次解冻移植囊胚中优质囊胚/解冻移植囊胚总数; 临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植囊胚周期数×100%; 着床率=B超下检测到孕囊数/移植囊胚数×100%; 异位妊娠率=异位妊娠周期数 / 临床妊娠周期数× 100%; 多胎率= 多胎妊娠周期数 / 移植周期数× 100%。
1.5 统计学分析 采用Graph Pad prism5版统计软件对结果进行统计学分析, 多组定量资料用均数±标准差(x- ±s)表示, 比较采用t 检验, 不符合正态分布的行秩和检验; 定性资料中率(%)的比较采用χ2检验,当理论频数<1时, 采用Fisher确切概率法计算概率,P<0.05 为差异具有统计学意义。
2.1 第 5 日、第 6 日囊胚 SET 和 DET 后情况比较 由表 1 所示, 各组患者的年龄、不孕年限、体质量指数( B M I ) 、G n 使用总量、G n 使用时间、基础 FSH 值、移植日内膜厚度等一般情况比较, 差异均无统计学意义(P>0.05), 组间有可比性.第 5 日 SET 和 DET 组的获卵数、2PN 数、受精率、囊胚形成率、优质囊胚率、临床妊娠率以及胚胎着床率均高于第 6 日组, 差异均有统计学意义(P<0.05)(表 2)。第 5 日 DET 组生化妊娠率显著高于其他组, 而第 5 日 SET 组与第 6 日 DET 组差异无统计学意义(P<0.05)。第 5 日和第 6 日 DET 组多胎妊娠率均显著高于相应的 SET 组(P<0.05)(表 2)。
2.2 移植优质囊胚下第 5 日、第 6 日囊胚 SET 和DET后情况比较 表3所示, 各组患者年龄、不孕年限、B M I 、G n 使用总量、G n 使用时间、基础FSH 值、移植日内膜厚度等一般情况比较, 差异均无统计学意义(P>0.05)。第 5 日 SET 和 DET 组的获卵数、2PN 数、受精率、囊胚形成率以及胚胎着床率均高于第6日组,差异均有统计学意义(P<0.05)。第5日和第6日SET组的生化妊娠率、临床妊娠率和多胎妊娠率均低于对应的 DET 组(P<0.05)。
2.4 P周期第5日、第6日SET情况比较 P周期共135例, 其中第5日组SET 100个周期, 第6日组 S E T 3 5 个周期。两组患者年龄、不孕年限、BMI、Gn 使用总量、Gn 使用时间、基础 FSH 值、移植日内膜厚度等一般情况比较, 差异均无统计学意义(P>0.05)(表 5)。由表 6 示第 5 日组的生化妊娠率、临床妊娠率以及着床率均高于第 6 日组, 差异均有统计学意义(P<0.05)。
近年来研究表明FET 能够获得与新鲜移植周期相当甚至更好的妊娠结局, 在辅助生殖技术助孕中具有良好的应用前景[10]。在FET周期中, 影响胚胎移植成功的因素很多, 包括子宫内膜容受性、胚胎质量以及患者心理因素等, 其中一个关键因素是选择最具发育潜能的胚胎进行移植。在新鲜囊胚移植周期中, 第5日囊胚移植的妊娠率和种植率明显高于第6日[11-13], 但冻融囊胚周期中不同发育囊胚移植的选择目前仍然存在争议, 而囊胚移植的妊娠结局在冻融周期中明显优于新鲜周期。因此, FET 周期中如何选择高质量的胚胎以及如何提高妊娠结局, 是临床上目前迫切需要解决的问题。
3.1 冻融周期囊胚移植的选择 冻融周期妊娠结局与囊胚发育、级别以及移植数目显著相关。Levens 等[14]回顾性分析了172例第5日与第6日冻融囊胚移植妊娠结局, 第5日种植率)显著高于第6日;Ercan等[15]的研究表明, DET多胎率(32.5%)显著高于单囊胚移植(2.8%); Oron 等[16]对1 541例不同级别囊胚移植结局回顾性分析结果显示移植评分高的囊胚可获得更高的临床妊娠率和活产率。本研究结果显示, 第 5 日生化妊娠率、临床妊娠率、着床率均高于相应第 6 日 SET、DET; 相同发育 SET、DET相比较, DET的多胎率显著高于SET; 与之前报道结果一致[17-18]。多胎妊娠时母亲孕产期并发症,如重度子痫前期、妊娠期心脏病、产后出血以及子宫切除的发生率均明显增高, 严重着母婴健康[19]。因此, 我们可以通过选择SET降低多胎妊娠的发生。其次, 本研究结果显示第 6 日组 2PN 数、受精率、囊胚形成率、第 5 日 / 第 6 日囊胚比以及优质囊胚率均显著低于第5日组, 且第5日囊胚移植妊娠结局明显优于第6日; 可能原因如下: ①第6日囊胚较第5日囊胚发育有所延迟, 胚胎质量可能低于第 5 日, 第 5 日囊胚较 第 6 日囊胚 DNA 损伤可能更少[20]; ②第 6 日扩张充分、评分高的囊胚,由于发育延迟, 囊胚细胞数目增加, 新陈代谢活动更多, 囊胚腔更大, 可能在一定程度上影响玻璃化冷冻复苏的效果, 继而影响冻融周期的种植率和临床妊娠率。第 5 日囊胚在玻璃化冷冻复苏过程中对冷冻损伤的耐受性可能更好一些[21-22]。早期胚胎发育是一个复杂的、连续的动态过程, 在不同发育阶段表现出不同的生理特征, 卵子成熟度、受精卵原核评分、受精率、胚胎形态评分以及优质囊胚率等都与胚胎发育潜能存在一定的相关性[23-26]。还有研究[27-28], 胚胎发育潜能与胞质内线粒体含量明显相关, 第5日囊胚线粒体含量可能高于第6日。
3.2 P周期冻融囊胚移植的选择 目前, P已经是辅助生殖领域中不可或缺的一项重要技术。P 活检过程了透明带的完整性, 活检后的胚胎经过冻融后存活率降低[29]。Scriba等[30]对P 后的囊胚进行了玻璃化冻融研究, 在光学显微镜下观察胚胎的超微结构, 结果表明胚胎解冻后在光学显微镜下所见结构与未经 P 的囊胚没有明显区别。但是第 5 日与第 6 日冻融囊胚经 P 筛查后显示 DNA正常的囊胚其移植选择目前尚缺乏研究。本研究结果显示第 5 日 SET 的生化妊娠率、临床妊娠率以及胚胎着床率均优于第 6 日。由于 P 是选择没有特定遗传物质异常的胚胎进行移植, 胚胎既要经过形态学的判定又要接受遗传学诊断, P后可用于冻存的胚胎较少, 因此纳入本研究的周期数较少。综上所述, 在胚胎冻融移植周期中, 第5日与第6日同是优质囊胚的情况下, 优先选择第5日囊胚进行移植可获得较高的临床妊娠率和种植率。第 5 日SET、DET 着床率未见统计学差异, 但双囊胚移植多胎妊娠的风险升高, 因此推荐优先选择第5日单囊胚移植, 以获得较高妊娠率和较低的母儿并发症。对无第5日囊胚形成的患者, 尽管第6日囊胚移植着床率较低, 但仍有高达36%的几率可获得着床, 从而最大限度地利用胚胎, 减少患者的损失。因此, 在临床工作中, 我们应结合囊胚发育、囊胚级别、患者的年龄、卵巢功能状况以及促排卵反应性等进行综合考虑、权衡利弊以决定是否移植或移植发育几天的囊胚。
来源：武龙梅、邹薇薇、纪冬梅、陈福才，不同发育囊胚冻融移植后妊娠结局分析[J].中华生殖与避孕，2017，37（10）：779-785.
