今天准备跟大家分享一下 qPCR 引物设计的具体流程。在进行引物设计之前，首先大家都应该了解引物设计需要注意的一些细节与原则，归纳如下：
1. 要设计引物首先要找到 DNA 序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
11. 引物的 3 端要与模板严格配对，而 5 端碱基没有严格的限制，只要与模板 DNA 结合的部分足够长，其 5 端碱基可不与模板 DNA 配对而呈游离状态，这样，我们可以在引物的 5 末端加上酶切位点（引入酶切位点时，要考虑到进行双酶切的共用缓冲液，否则给下游工作带来困难）、启动子，方便下游操作。
了解了设计原则，接下来我们就看看具体的设计流程，本次讲解应用 pubmed 来设计。比如我们要设计小鼠源性白介素 4（IL－4） 的引物。
