分析吡哆醇依赖性癫痫(PDE)患儿的临床及遗传学特点，建立尿液哌啶酸的检测方法，分析PDE患儿吡哆醇治疗过程中尿液哌啶酸的浓度。
对2012年4月至2015年9月在北京大学第一医院儿科确诊的12例PDE患儿(男8例、女4例)的临床表现、诊治过程、脑电图及神经影像学资料进行回顾性分析；采用Sanger测序或靶向捕获二代测序技术进行ALDH7A1基因检测；采用气相色谱－质谱(GC－MS)方法测定PDE患儿的尿液哌啶酸浓度，并检测非PDE患儿的尿液哌啶酸作为正常对照。对照组为2015年11月至2016年1月于北京大学第一医院出生的新生儿或因晕厥等原因(不影响哌啶酸代谢)就诊的儿童共58例，其中≤6月龄组25例(男14例、女11例)，6月龄组33例(男14例、女19例)。哌啶酸浓度的组间比较采用两独立样本的t检验或Mann－Whitney检验；相关性分析采用Pearson或Spearman检验。
12例PDE患儿中7例母亲妊娠期或出生史异常，起病年龄为生后5 h～5个月，8例于生后10 d内起病。经过15 d～20个月的延迟诊断，患儿的癫痫发作最终均被吡哆醇单药控制，其中10例发作控制时吡哆醇剂量高于10.0 mg/(kg·d)，另2例分别为8.5和2.5 mg/(kg·d)。发作间期脑电图显示10例有非特异性异常，2例吡哆醇用药前后均正常；头颅磁共振成像显示7例为非特异性异常，5例正常。患儿均通过ALDH7A1基因检测确诊，共发现15种突变位点，其中4种为国际尚未报道的新突变。6例携带IVS11＋1GA突变，出现率25%(6/24)。至末次随访，11例患儿有不同程度的智力、运动发育落后，其中4例重度落后者出生史均有异常；1例未发现明显的发育异常。正常对照组中，≤6月龄组尿液哌啶酸浓度明显高于6月龄组[8.47(0.46～35.33)比0.66(0.12～3.52)mmol/mol肌酐，Z＝－5.464，P0.01]。12例PDE患儿检测时年龄均6月龄，尿液哌啶酸浓度0.14～4.08 mmol/mol肌酐(仅有1例浓度稍高于正常值上限)，与正常对照6月龄组差异无统计学意义(Z＝－0.655，P0.05)，与吡哆醇初始、末次随访维持剂量无相关性(r＝0.418、0.166，P＝0.176、0.697)。
PDE患儿多在新生儿早期起病。IVS11＋1GA突变出现率较高，可能为我国PDE患儿的热点突变。多数患儿癫痫发作控制后遗留不同程度的智力、运动发育落后，出生史异常者提示预后较差。未发现诊断延迟时间与智力、运动发育情况之间存在相关性。尿液哌啶酸浓度经吡哆醇长期维持治疗后可能恢复正常。
吡哆醇依赖性癫痫(pyridoxine dependent epilepsy，PDE，OMIM 266100)由Hunt等[]在1954年首次报道，是一种少见的常染色体隐性遗传病，特征为新生儿期或婴儿早期出现难以控制的癫痫发作，且抗癫痫药无显著疗效，大剂量吡哆醇可完全控制发作[]。2006年，ALDH7A1基因被确定为PDE的致病基因[]。ALDH7A1基因编码α－氨基己二酸半醛(α－AASA)脱氢酶，参与体内赖氨酸的分解代谢，该基因突变会引起α－AASA累积，后者在体内与Δ1－四氢吡啶－6－羧酸(P6C)处于自发平衡状态，导致P6C继发性累积，并进一步引起体内哌啶酸累积[]。因此，PDE患者体内α－AASA、P6C及哌啶酸浓度升高。2012至2015年在北京大学第一医院儿科通过ALDH7A1基因分析共确诊12例PDE患儿，并建立气相色谱－质谱(GC－MS)检测尿液哌啶酸浓度的方法，对患儿吡哆醇治疗过程中哌啶酸浓度进行检测，现回顾性总结PDE的临床及遗传学特点，并分析哌啶酸浓度与吡哆醇维持剂量、智力及运动和发育情况之间的关系。
2012年4月至2015年9月在北京大学第一医院儿科确诊的PDE患儿12例(男8例、女4例)。入组标准：(1)新生儿期或婴儿早期出现癫痫发作；(2)癫痫发作对抗癫痫药耐受；(3)大剂量吡哆醇(维生素B6)单药完全控制发作；(4)基因检测明确ALDH7A1基因突变。本研究获得了北京大学第一医院临床研究伦理委员会的批准(2005年第04号)，患儿家长均知情同意。
正常对照组为2015年11月至2016年1月于北京大学第一医院出生的新生儿或因晕厥等原因(不影响哌啶酸代谢)就诊于我院的儿童共58例。依据体内哌啶酸的年龄依赖性特点，将正常对照组分为2个年龄组(≤6月龄组，6月龄组)检测其尿液哌啶酸浓度作为正常对照[]。≤6月龄组25例(男14例、女11例)，6月龄组33例(男14例、女19例)。
回顾性分析患儿的临床表现、诊治过程及视频脑电图(VEEG)、头颅磁共振成像(MRI)结果。
采用Sanger测序或靶向捕获二代测序技术对PDE患儿进行ALDH7A1单个基因或癫痫相关基因包(含ALDH7A1基因)检测及分析[]。
委托北京摩尔美康分离检测技术有限公司完成，采用GC－MS分析方法检测。标准品、萃取试剂、衍生化试剂均购自北京百灵威科技有限公司。(1)将350 μl尿液移入制备小瓶，加入150 μl甲醇溶液，充分混匀后，高速离心12 000 r/min(离心半径6 cm)×10 min；移取上清液400 μl，加入1 ml乙酸乙酯萃取试剂进行液液萃取，将萃取后溶液常温下氮气吹干；加入100 μl BSTFA衍生化试剂，80 ℃温育30 min对样品进行衍生化；最后将样品移入样品瓶进行GC/MS分析。(2)GC/MS联用仪分析条件：①气相：色谱柱Rtx－5MS 30 m×0.25 μm×0.25 mm；进样口温度280 ℃；进样方式为分流(1∶10)；流量控制模式为压力(76.9 kPa)控制；线 cm/s；升温程序为100 ℃→10 ℃/min→300 ℃(10 min)。②质谱：离子源温度200 ℃；接口温度：280 ℃；溶剂切除时间为2.5 min。(3)以标准品所制标准曲线．辅助检查：
完善血液生化检查、血液氨基酸、尿液有机酸筛查等，进行头颅MRI检查及智力及评估(Gesell发育量表、临床粗略智力评估)。
通过门诊随诊或电话随访方式获得近期资料，主要包括发作情况、吡哆醇维持剂量、智力及运动发育情况等，随访时间为5个月至3.5年。
用SPSS 20.0软件进行统计学处理，采用Shapiro－Wilk检验方法对资料进行正态性检验；正态分布的计量资料用±
表示，非正态分布的采用中位值(范围)表示，组间比较采用两独立样本的t检验或Mann－Whitney检验，相关分析采用Pearson或Spearman检验。P0.05为差异有统计学意义。
12例患儿均经临床及基因检测确诊为PDE()。3例有生后窒息，2例有羊水污染，1例妊娠期有先兆流产，1例妊娠期有异常胎动，另5例出生史正常。患儿均为新生儿期或婴儿期起病，起病年龄为生后5 h～5个月，8例于生后10 d内出现癫痫发作。患儿均为局灶性发作，表现为双眼凝视或斜视，一侧或双侧肢体抽搐，伴或不伴口唇发绀。经过15 d～20个月的延迟诊断后，12例患儿的癫痫发作最终均被吡哆醇单药控制，其中10例发作控制时吡哆醇剂量高于10.0 mg/(kg·d)，另2例(例4、11)分别为8.5和2.5 mg/(kg·d)。VEEG检查结果显示10例发作间期为局灶性或多灶性尖波、尖慢波发放，2例在吡哆醇治疗前后经多次VEEG检查结果均正常。头颅MRI检查7例显示多种非特异性异常，包括白质信号异常、颞区蛛网膜下腔增宽、胼胝体发育不良、脑室扩大和脑发育不良等，5例未发现异常。所有患儿血液生化、血液氨基酸、尿液有机酸筛查等均未见异常。
ALDH7A1基因分析显示11例为复合杂合突变；1例为纯合突变。检测患儿父母基因型确定上述突变均分别遗传自父母，符合PDE的常染色体隐性遗传特性。共发现15种不同的突变位点()，其中4种(c.649TA、c.1061AG、c.1072CT、c.1553GC)为国际未报道的新突变，IVS11＋1GA突变出现于6例患儿中。
采用Sanger测序或目的基因靶向捕获二代测序技术获得12例PDE患儿的ALDH7A1基因突变位点，其中Y354C、E427Q、Y516C、IVS9＋5GA、IVS11＋1GA出现次数≥212例患儿分别随访5个月～3.5年。至末次随访，患儿年龄为6个月4 d～4岁7个月，吡哆醇维持剂量2.6～15.0 mg/(kg·d)，所有患儿的癫痫发作均被完全控制。11例有不同程度的智力、运动发育落后，其中4例轻度落后、3例中度落后、4例重度落后，例9年龄尚小未发现明显的发育异常。
＝－5.464，P0.01]。12例PDE患儿进行尿液哌啶酸浓度检测时年龄均6月龄，结果为0.14～4.08 mmol/mol肌酐()，与正常对照6月龄组差异无统计学意义(Z＝－0.655，P＝0.513)。PDE患儿尿液哌啶酸浓度与吡哆醇初始剂量、末次随访维持剂量之间均无相关性(r＝0.418、0.166，P＝0.176、0.607)。PDE是少见的常染色体隐性遗传病，国际共报道200余例，有关发病率的报道较少且差异很大，为1∶20 000～1∶600 000[]。目前PDE的诊断首先依靠临床疑诊，有条件的实验室可检测生化标志物进一步提示诊断，最后基因检测确诊。由于此病少见，临床医生诊断经验不足，常导致漏诊而延误治疗。本组12例中7例妊娠期或出生史异常，且1例妊娠期曾有异常胎动，提示宫内发作的可能性[]。8例患儿生后10 d内出现癫痫发作，但有1例生后5个月起病，更有报道指出起病年龄可晚至3岁[]。既往研究报道PDE患儿发作形式多变，包括局灶性发作、痉挛发作、肌阵挛发作、强直－阵挛发作、失张力发作，甚至癫痫持续状态等[]，本组患儿均为局灶性发作，可能因病例数尚少，不能全面反映PDE的发作类型；既往报道的PDE病例多为临床拟诊，未经基因检测确诊，有可能将部分吡哆醇反应性癫痫患儿误诊为PDE所致，如吡哆醇反应性婴儿痉挛[]。本组中VEEG及MRI检查结果均未发现可提示诊断的特异性改变。本研究发现的15种ALDH7A1突变位点中，4种为国际未报道的新突变，另有5种已由本课题组首次报道[]。ALDH7A1基因共包含18个外显子，突变主要集中于第11、12、14、17号外显子上，其中第11内含子IVS11＋1GA突变出现率较高(25%)，可能为我国PDE患儿的热点突变[]，提示在进行基因筛查时应重点考虑这些区域。
至末次随访，所有患儿的癫痫发作均被吡哆醇单药控制，但11例出现不同程度的智力、运动发育落后，且4例重度落后患儿出生史均有异常，提示此类患儿预后相对较差。但是，出生史正常的患儿预后存在个体差异性；不同患儿延迟诊断时间不同且吡哆醇维持剂量也不尽相同，并未发现诊断延迟时间与智力、运动发育情况之间的明确相关性，早治疗并不能确保预后好。PDE预后可能主要受ALDH7A1基因突变位点的影响[]，但本组中1例携带E427Q纯合突变的患儿智力、运动发育仅为轻度落后，而据报道，E427Q突变会影响NAD＋辅酶结合或催化区域，从而使酶活性完全丧失[]，因此携带此突变的患儿预后较差。本研究及国外的研究提示本病预后除受基因型影响外，其他因素如起病年龄、饮食中赖氨酸的摄入量、合成及分解代谢差异、其他环境因素等对预后也有一定的影响[]。
ALDH7A1基因突变可导致血液、尿液、脑脊液中的α－AASA、P6C和哌啶酸浓度升高，三者均可作为诊断PDE的生化标志物[]。其中，α－AASA是α－AASA脱氢酶的直接底物，在基因突变后最先被影响，并与P6C处于自发平衡状态，故PDE患者体内α－AASA和P6C浓度远高于哌啶酸[]。由于α－AASA和P6C稳定性差，在室温下极易降解[]，检测困难且难以精确定量，较难应用于临床。因此，尽管哌啶酸的特异性相对较低[]，但其稳定性好、灵敏度高，易于临床普及、应用。国际上仅有美国、荷兰、奥地利等少数国家可进行PDE生化标志物的检测[]。考虑到尿液相对易于获得且无创，我们建立了通过GC－MS检测尿液哌啶酸浓度的方法。根据哌啶酸具有年龄依赖性的特点，分组收集作为正常对照；检测结果与已报道的GC－MS方法测得的正常范围(mmol/mol肌酐：≤6个月者为0.55～24.1；6个月者为0.01～1.54[])相近，证明所建方法可靠。因α－AASA的化学本质是活性半醛，可参与细胞内的多种化学反应，继而影响多条代谢通路，PDE患儿体内α－AASA蓄积可能对脑组织产生直接的毒性损害[]，尿α－AASA浓度高者临床表型更严重[]，而哌啶酸累积继发于α－AASA蓄积，因此，尿液哌啶酸浓度可能一定程度上反映患儿预后；有报道，尿液哌啶酸浓度在治疗之前可高至正常高限的17倍，长期应用吡哆醇治疗后可明显降低甚至恢复正常[]，因此，尿液哌啶酸水平可能有助于调整吡哆醇维持剂量。本研究进行哌啶酸检测时，12例PDE患儿均为吡哆醇单药治疗，且吡哆醇维持剂量与末次随访时一致，仅有1例稍高于上限，但并未发现此例吡哆醇剂量过低或智力、运动发育情况更差。PDE患儿与6月龄正常对照组间哌啶酸浓度无明显差异，推测可能与本组PDE患儿均经数月至数年的吡哆醇治疗，尿液哌啶酸浓度多数已恢复正常有关，较为遗憾的是由于哌啶酸检测方法刚刚建立，本组患儿均未能在吡哆醇治疗前被证实尿液哌啶酸水平高于正常。研究提示PDE患儿个体间异常增高的尿液哌啶酸浓度差异较大，考虑哌啶酸浓度更可能由所携带突变位点不同决定[]。但当个体间哌啶酸浓度在正常值范围内，此时数值上的差异不具有病理性意义。
本研究通过建立尿液哌啶酸检测方法，使我国PDE的生化标志物的快速筛查成为可能。未来对新诊断的PDE患儿可测定吡哆醇治疗前、治疗后不同病程阶段的尿液哌啶酸水平，以助于PDE的早期诊断，并可指导临床吡哆醇长期用药。
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